细数光谱流式的脱胎之路_检测

目前最流行的细胞检测分析技术是基于荧光的流式细胞术 (Flow cytometry, FCM)。因其具有同时检测多参数和高通量的特点，流式细胞术已发展成为生命科学领域研究中最为广泛使用的技术，可以用来鉴定细胞亚群，并分析特定亚群的生物学功能。

现代流式细胞技术诞生于上世纪60年代，历经半个世纪的发展，从仪器构造和检测试剂的商品化，极大地拓展了单细胞分析的参数维度。如今流式仪器已从最初的单激光逐渐增加为3根、5根乃至7根激光，亮度更高 以及光谱选择更多的荧光素也随之陆续开发问世，用于满足流式检测应用对试剂的需求。

现代FCM技术发展变革历程

与此同时，研究者们也开发改造出了种类繁多的荧光蛋白用于动物实验，从蓝光波段到红外波段均有覆盖。此外，荧光共振能量转移的融合蛋白结构也被用于评估蛋白与蛋白间的相互作用和其他细胞功能型实验。这使得荧光蛋白在流式实验中，已成为必不可少的一种荧光报告工具。由此衍生出的一个问题是，如何实现光谱临近的荧光蛋白和多种荧光素染料同时检测？

不同波长范围的荧光蛋白示意

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基于滤光片的传统流式技术特点

目前的流式技术一般选择使用二向 色镜和带通滤光片组合来接收荧光信号，因为在传统概念上人们选择每一种荧光素对应着某一个特定的荧光检测通道，如此形成了现在的滤光片数目对应着荧光素检测数量的默认原则。然而由于荧光素的发射光谱往往表现出连续广泛的分布形式，导致其他检测通道也会收集到临近通道的荧光信号，这就需要我们在做多色实验时，必须同时准备荧光素单染管，用来计算相邻通道的荧光溢漏比例。

荧光染料光谱重叠示意

在过去的半个世纪中，流式已经从最初的单色检测发展到2色、3色和4色检测，至1997年有报道提到当时可实现8色方案的流式检测，2001年这一数字发展为11色，随后很快更新为18色，已发表文献中最新的极限检测数据是OMIP-63提供的29色检测方案。但对于传统流式来说，由于荧光溢漏问题，一般单根激光器能配备的检测通道在5-7个之间，基本不会超过8个。这形成了如今流式技术的最大制约，即颜色数量提升的难以为继。

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传统流式技术局限

随着免疫学和诊断医学领域的研究不断深入，如今的流式实验仍然聚焦于同时检测更多颜色，很多研究已经对30色乃至40色以上的多色方案提出了需求。但基于二向色镜和滤光片原理的传统流式已很难继续向前突破，加之传统流式复杂繁琐的补偿计算问题在超多色方案实验中更加凸显。面对日趋旺盛的超多色流式检测需求，传统流式已经显露出疲于应付的状态。在此情况下，人们不禁开始思考是否存在其他更多更快的流式数据检测和分析方法。

2019年ISAC关于未来流式发展趋势的全球调研报告

针对传统流式的 技术瓶颈，研究者们发展出了 光谱流式 (Spectral flow cytometry)和 质谱流式 (Mass cytometry)两类单细胞多标记检测分析技术，可以为研究者提供40色乃至更高的单细胞超高参数分析能力，配合先验性监督算法或无监督类的解析算法对高维数据进行降维或聚类分析，因此从根本上避免了荧光光谱重叠所导致的补偿问题。

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光谱流式起源

从很早开始，人们就认识到如果可以收集到细胞的全光谱信息，那么就能够通过数据分析获得样本的更多潜在生物学信息。在1979年Wade等人最早尝试了使用流式系统记录样本的光谱信息，可惜的是当时的仪器设计不能实现单个颗粒的光谱记录。1986年Steen和Stokke检测了大鼠胸腺细胞的平均荧光光谱；1990年Buican使用傅立叶变换干涉仪实现了单个细胞的光谱记录；1996年Gauci提出使用棱镜分光配合PD阵列检测光谱信息；2001年SoftRay公司联合Wyoming及Utah大学的研究者，共同提出了另一套基于棱镜的光谱检测概念。早期的这些光谱仪在结构上均有检测速度、灵敏度和光谱分辨率不足的缺陷，限制了光谱流式的继续发展。

光谱流式概念发展起源

随着仪器光路结构/检测器、电子元器件和分析软件的不断发展迭代，新世代的光谱流式在仪器光路结构设计和数据分析处理方面有不同发展方向，足以满足大量细胞样本的快速检测和高分辨率的全光谱分析，孰优孰劣最终还需具体的以生物样本对分析对象的实验结果来做评断。

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光谱流式与传统流式的异同

1. 仪器构造

传统流式和光谱流式的区别主要有两个方面：一是分光方式，传统流式采用二向色镜和滤光片组合来对不同波段的荧光进行区分，而光谱流式则倾向于采用棱镜或者光栅进行全波段的色散分光；二是信号检测器，由棱镜/光栅分光产生的连续光谱信号需要配合线性检测器阵列（一般是CCD或者多阳极PMT）实现全光谱信号获取，因而分光能力和检测器灵敏度二者共同决定了光谱流式的光谱信号分辨率。

传统流式和光谱流式的光路结构及信号检测区别

尽管滤光片系统和32通道PMT阵列间的灵敏度和光谱分辨率有所不同，对于同样的样本数据分析而言，两者可以形成极好的数据一致性，线性回归相关系数可达到95%以上。

光谱数据与常规流式数据的一致性对比

（数据来源：DOI: 10.1002/cyto.a.21120）

2. 实验方案设计

在流式实验的基础设置内容上，如仪器校准/抗体滴定/设置生物学对照等，光谱流式和传统流式并无二致。由于光谱流式将荧光素光谱当作类似指纹的特异性标志来处理，并有能力将此指纹光谱记录于操作软件中存储为光谱库，故而光谱流式可以省略重复的单染管制备，这种特性可以极大地简化当前多色流式实验的操作流程和试剂与样本用量。

光谱指纹的唯一性支持其可以反复用于光谱数据解析

传统流式的实验检测方案可直接平移至光谱流式。当某一类实验中样本光谱携带有重要信息时，例如环境敏感性荧光探针和荧光共振能量转移探针，光谱流式尤显重要。其中一个重要应用是细胞内源性荧光——自发荧光检测。自发荧光在流式检测的背景噪音中占据重要比例，不同细胞表现出不同的自发荧光，特别是原代异质性组织样本。有趣的是，特定类型的细胞自发荧光和荧光素一样，具有特定的光谱峰形，这使得光谱流式可以将自发荧光当作某种荧光素来处理，实现从样本检测的混合荧光信号中剥离自发荧光，获取特异性的真实荧光信息。

PBMC样本自发荧光解析

3. 数据分析

对于传统流式， 多色实验需要检测单染管计算单染荧光素在其他通道的荧光溢漏比例，建立补偿矩阵以实现多色数据的准确分析。对于光谱流式，则有两类算法用于处理光谱数据：先验性监督算法和无监督的聚类算法。先验性监督算法是基于已知数量的标准光谱作为解析范例，使用荧光单染管计算荧光素光谱特征，拆分混合荧光信号中各荧光素独立表达强度和仪器背景噪音，常用算法以泊松分布最小二乘法为代表。无监督聚类算法是在一切信息未知的前提下，通过渐进因子分析方式从原始光谱数据中提取主要参数信息，以主成分分析 (PCA) 为代表的算法常用于这一类数据的前处理步骤。

光谱数据几种常用的先验性解析算法

（普通最小二乘法OLS会导致明显的spread）

光谱流式可将每一个光谱通道存储为数据点，以此生成标准流式数据FCS文件，配合其他第三方流式软件实现深度数据分析功能。在同样的数据分析处理原则上，鉴于光谱流式可以提供更多的荧光信息和marker信息，因而研究者可从光谱流式数据中提炼更多的潜在生物学信息。

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【真·全光谱】洞悉光谱技术原理，轻松掌握超多色流式

作为光谱流式技术应用化的先行者，SONY在此领域仍在继续探索这一技术的未来可能性。2019年温哥华CYTO大会，SONY发布了全新的旗舰型光谱流式仪ID7000，多达7根激光器配合光栅分光的32通道PMT检测器阵列，实现了183个荧光参数的单细胞全光谱分析，将光谱流式技术带领到前所未有的超定检测系统领域。

2019年CYTO大会Sony发布超多色旗舰型光谱流式仪ID7000

Reference:

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索尼超高参数全光谱流式分析仪